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Duke工程师利用生物医学尾巴改进CRISPR基因组编辑

DURHAM - 杜克大学的生物医学工程师已经开发出一种方法,可以将CRISPR基因组编辑技术的准确性平均提高50倍。他们相信它可以很容易地翻译成任何编辑技术不断扩展的格式。

这种方法为指导RNA添加了一个短尾,用于识别DNA序列以进行编辑。这种添加的尾部向后折叠并与自身结合,形成“锁定”,只能通过目标DNA序列解除。

该研究于4月15日在线发表在Nature Biotechnology杂志上。

]“CRISPR通常非常精确,但也有例子已经表现出偏离目标活动的人群,因此在整个领域对提高特异性有广泛的兴趣,“杜克大学生物医学工程鲁尼家庭副教授查尔斯格斯巴赫说。 “但到目前为止提出的解决方案不能轻易地在不同的CRISPR系统之间进行转换。”

CRISPR / Cas9是一种防御系统,细菌用它来靶向和切割入侵病毒的DNA。虽然设计用于人体细胞的CRISPR技术的第一个版本来自一种叫做化脓性链球菌的细菌,但更多的细菌物种带有其他版本。

该领域的科学家花了数年时间寻找具有理想特性的新型CRISPR系统。并不断添加到CRISPR库中。例如,某些系统是sm过敏和更好地适应病毒载体内部以递送到人类细胞进行基因治疗。但无论他们的个体能力如何,所有人都有时会产生不必要的遗传编辑。

CRISPR系统的一个共同特性是他们使用RNA分子作为基因组中靶向DNA序列的指南。一旦指导RNA找到其互补的基因序列,Cas9酶就像剪刀一样在DNA中切割,促进基因组序列的改变。但是因为每个归巢序列只有20个核苷酸长,而人类基因组含有大约30亿个碱基对,所以需要排序很多,而且有时候一个或两个碱基对缺乏完美的序列会导致错误。

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Charles Gersbach(杜克大学照片)

提高CRISPR准确度的一种方法是要求两个Cas9分子结合到同一DNA序列的相对侧,以进行完整切割。虽然这种方法有效,但它会给系统增加更多的部分,增加其复杂性并使其更难实现。

另一种方法是对Cas9蛋白进行基因工程改造,使其不那么精力充沛,因此不太可能跳枪并犯错误。虽然这也显示了有希望的结果,但这种类型的蛋白质工程是费力的,并且这种努力对于每个CRISPR系统都是特定的。

“似乎每隔几周发现一种新的CRISPR系统,它具有某种形式独特的财产,使其对特定的应用程序有用,“葛说rsbach。 “每当我们发现新的CRISPR蛋白质以使其更准确时,进行广泛的重新设计并不是一个简单的解决方案。”

“我们专注于一个不添加更多部件的解决方案,并且是一般性的对于任何一种CRISPR系统,“在Gersbach实验室工作的博士生Dewran Kocak说道,他领导了这个项目。 “所有CRISPR系统的共同点是指导RNA,这些短RNA更容易设计。”

Gersbach和Kocak的解决方案是将指导RNA扩展多达20个核苷酸,使得它折叠回自身并结合到原始指导RNA的末端,形成发夹形状。如果即使单个碱基对在被检查的DNA序列中不正确,这也会产生一种非常难以取代的锁定可能的削减。但由于指导RNA更倾向于与DNA结合而不是自身,DNA的正确组合仍然能够打破锁定。

“我们能够微调锁的强度因此,指导RNA在满足其正确匹配时仍能正常工作,“Kocak说。

在论文中,Kocak和Gersbach表明,这种方法可以提高人体细胞切割的准确性。来自四种不同细菌菌株的五种不同CRISPR系统的50倍。在一个案例中,改善率上升到200多倍。

“这是一个非常简单的想法,尽管Dewran完成了几年的研究,表明它的工作方式与我们认为它的工作方式一致,”Gersbach说。 。 “这是一个很好的,elega解决脱靶活动的解决方案。“

展望未来,研究人员希望看到这种方法可以使用多少种不同的CRISPR变体,并完整地深入描述锁定机制用于查看CRISPR变体之间是否存在差异。由于这些实验是在培养的细胞中进行的,研究人员迫切希望看到这种方法在实际动物疾病模型中如何提高CRISPR的准确性。

这项工作得到了Paul G. Allen Frontiers Group的支持。 ,美国国立卫生研究院(DP2OD008586,R01DA036865,R01AR069085,P30AR066527)和国家科学基金会(DMR-1709527,EFMA-1830957)。

(C)杜克大学

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